纳米脂肪衍生物的研究进展与医疗美容

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  作者:郑洋洋 刘毅,.兰州大学第二临床医学院,解放军联勤保障部队第九四 医院 烧伤整形科

  2013 年,Tonnard 等[1]通过机械乳化作用,将颗粒脂肪制 备成可以顺利通过 27 G 针头的乳糜状脂肪,并发现这种脂 肪含有大量的脂肪来源干细胞 (adiposev derived stem cell, ADSCs)。其与颗粒脂肪及微粒脂肪中的 ADSCs 相比,具有同 样的增殖以及脂肪分化能力,而将这种乳糜状脂肪注入患者 皮下 6 个月后,患者的浅表皱纹、下睑皮肤松弛以及黑眼圈 等症状得到了改善,由此将这种乳糜脂肪命名为纳米脂肪。 纳米脂肪具有独特的优势,现已被广泛应用于改善皮肤质 地、减轻瘢痕[2-4]、毛囊再生[5]、提高皮瓣成活率[6]以及改善颞颌 关节紊乱[7]等的治疗中。此外,纳米脂肪与传统脂肪移植、激 光、富血小板血浆等联合应用, 可提高疗效[8-10]。然而,纳米脂 肪在治疗过程中也存在一些缺陷:⑴由于机械剪切力的破 坏,使纳米脂肪中的脂肪细胞数量减少,导致其填充能力非 常有限[1]。⑵成熟脂肪细胞被破坏成细胞碎片以及释放出油 脂,注入人体后被巨噬细胞吞噬,少量油脂与细胞碎片可以 通过引起炎症反应及释放生长因子来修复注射区域。然而过 多则会引起强烈的炎症反应,造成水肿以及纤维增生,从而 影响临床效果[11]。有研究表明, 多余的油脂是引起脂肪移植体 积减少和油囊产生的原因之一[12]。⑶纳米脂肪中含有一定量 的 ADSCs,在机械加工过程中可能会影响 ADSCs 基因的稳 定性, 并产生与细胞移植有关的致瘤性问题[13]。 ⑷与颗粒脂肪 以及微粒脂肪相比,纳米脂肪的血管基质细胞片段(stromal vascular fraction, SVF)和 ADSCs 的数量较少,因此在一些临 床观察中,患者的皮肤质地并没有发生显著变化[14]。 针对纳米 脂肪存在的这些问题,近年来开展了对于纳米脂肪衍生物的 探索研究,旨在保证脂肪组织顺利通过 27 G 针头的同时,打 破纳米脂肪的局限性,弥补其在临床应用过程中的不足,进 一步实现纳米脂肪的填充和再生作用。

  

纳米脂肪衍生物的研究进展与医疗美容

 

  1、自体纳米活性脂肪

  细胞活力被认为是影响移植脂肪组织长期成活和再生 的重要因素[15],而纳米脂肪制备过程中的机械作用破坏了脂肪细胞的活性,从而导致了填充作用的局限性。Chen 等[16]在 使用纳米脂肪治疗大鼠糖尿病足创面的实验中,通过扫描电 镜观察发现,大鼠的纳米脂肪相比人类的纳米脂肪具有更厚 的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、 更多的结缔组织和 胶原纤维束。而 JS Choi 等(2010 年)研究表明,ECM具有机 械支撑作用,可以保护成熟脂肪细胞免受机械作用的破坏, 以保留更多的脂肪细胞,这可能是在大鼠纳米脂肪处理的足 部创面中发现活性脂肪细胞的原因之一。同年,E Vorotnikova 等研究表明,ECM可通过促进 ADSCs 的分化来诱导脂肪再 生,作为自然支架,也可以为脂肪再生提供环境。由此推测, 人类纳米脂肪之所以缺乏填充效果,可能与其缺乏活性的 脂肪细胞或低密度的 ECM有关。如果提高其 ECM的含量或 活性脂肪细胞的数量,优化填充功能将成为可能。2018 年, Bi 等[17]报道了一种新的纳米脂肪衍生物—“自体纳米活性脂 肪” ,其制作过程是:⑴将低浓度的Ⅰ型胶原酶在 37 ℃条件 下,消化脂肪组织 15 min。⑵以 330 r/min 离心 7 min 并收集上 清液。⑶收集的上清液经过孔径为 0.6 mm 的细胞过滤器过 滤后,得到的滤出液即为自体纳米活性脂肪。自体纳米活性 脂肪中含有大量的集落形成细胞(colony forming cells),其含量 远高于纳米脂肪,并表达 ADSCs 的表面标记,且具有多向分 化能力。相比于纳米脂肪,纳米活性脂肪显示出更佳的细胞 成活率以及良好的填充优势。将其注入患者的颈纹处,随访 6 个月后发现,改善颈纹的效果较稳定。在纳米活性脂肪的制 备过程中,由于直径较大的脂肪细胞较脆弱,易被酶破坏,而 直径较小的脂肪细胞以及 ADSCs 得以存活,因此保证了自体 纳米活性脂肪在顺利通过 27 G 针头的同时,还保持了脂肪 细胞以及 ADSCs 的活性,使其在填充软组织缺损的同时,能 够进行组织再生。虽然使用酶消化代替了机械作用,但胶原 酶浓度以及消化时间远低于 ADSCs 分离时的浓度和时间[18]。 然而该作者并未对其具体作用机制进行解释,如在缺氧的环 境下成熟脂肪细胞如何存活,炎症反应如何发生,酶消化对 ECM有无破坏作用,破坏程度如何,以及其远期临床稳定性 等问题都需要进一步探索。

  2、无细胞脂肪提取物

  纳米脂肪的再生能力与 ADSCs 有关。一些研究表明, ADSCs 主要通过分泌多种生长因子而发挥再生作用[16,19]。多项实验研究表明,无论是新鲜脂肪组织[20],还是新鲜脂肪抽吸物 及纳米脂肪[21-23],脂肪组织 ECM自身富集多种生长因子,可直 接分离出来供临床使用,无需细胞分离或培养,由此可避免 涉及临床应用中与细胞有关的问题,包括细胞的基因稳定 性、注射后的细胞活性和成活率、细胞储存的多重管理、使用 异源性脂肪时的免疫原性,以及不稳定和不可预测的治疗效 果。因此,Yu 等[24]研制出了无细胞脂肪提取物(fat extract,FE), 用机械离心的方法去除纳米脂肪中的油脂、细胞碎片以及细 胞,从而纯化含有生长因子的液体部分。其具体操作步骤如 下:⑴冲洗脂肪抽吸物, 去除红细胞。⑵1200 r/min 离心 3 min。 ⑶将得到的脂肪组织进行机械乳化,变成纳米脂肪。⑷在 - 80℃中冰冻乳化脂肪并在 37℃中解冻(不改变生长因子在 FE 内的浓度)。⑸以 1200 r/min 再次离心 3 min。经此过程处理 的脂肪组织最后分为 4 层,从上至下依次为油脂、未被破坏 的脂肪组织、FE、碎片。将第 3 层的 FE 经过 0.22 μm 的过滤 器过滤细菌以及未被除去的细胞碎片,便得到最终产物。该 实验检测到,FE 中含有多种促进血管生成的生长因子,将其 应用于下肢缺血的小鼠模型中,可缓解缺血症状并减少坏死 面积。Cai 等[25]在研究 FE 与大鼠皮瓣成活率的关系时发现, FE 可以改善皮瓣移植初始期的缺血状态,提高皮瓣的成活 率。因此,FE 是一种潜在的用于治疗缺血性疾病的临床产 品,其通过多种生长因子的联合作用,可加速血管生成,以此 来改善机体缺血状态。其整个制作过程相对简单安全,因为 只使用物理方法破坏和分离脂肪组织,并没有涉及酶和化学 试剂的应用。而且 FE 在 - 20 ℃的条件下可以保存 6 个月, 对 活性无影响。然而,生长因子的半衰期较短,FE 的功能具有 短暂性,因此在临床实践中可能需要实施多次治疗。在以后 的实验研究中,应该进一步探索 FE 浓度与临床效果的关系, 并观察其效果的稳定性,甚至可以对比 FE 与纳米脂肪以及 ADSCs 在不同疾病模型下的治疗效果,以期为选择临床治疗 方案提供参考。

  3、浓缩纳米脂肪

  浓缩的 SVF/ADSCs 是获得更好脂肪移植效果的关键,而 往往经过抽吸获得的脂肪组织,其 SVF/ADSCs 的含量比正常 脂肪组织少。要想获得含量较高的 SVF/ADSCs 一般需要 2 种 方法: 一种是经酶消化获得; 一种是通过机械作用力获得。机 械作用力通常包括离心、机械切碎或泥化,而离心法是较流 行的机械处理方法,它不仅能将油脂和细胞碎片从脂肪抽吸 物中分离出来,而且还能破坏表面脆弱的脂肪细胞,导致组 织中的 ADSCs 进一步浓缩[26]。JS Coleman(1997 年)临床研究 显示,离心脂肪组织比非离心脂肪组织寿命更长,美容效果 更好,其效果甚至与昂贵的自动脂肪移植处理设备相当[27]。 因此,临床工作者往往将纳米脂肪与离心技术结合起来,以 达到更好的临床效果。Zheng等[14]将纳米脂肪进行 1200 r/min 离心 3 min,并将其注射到光老化裸鼠的模型中,通过与未离 心的纳米脂肪相比发现,其改善皱纹以及皮肤质地的效果更 好。Gentile 等[28]将纳米脂肪经过不同速度的离心处理,得到 了 3 种改良后的纳米脂肪,分别为“supercharged- modified 纳 米脂肪”“evo- modified 纳米脂肪”“centrifuged- modified 纳米脂肪”。在应用于对瘢痕患者的治疗中发现,临床疗效与 SVF 含量呈正相关,而含量越高临床满意度越高。Pallua 等[29]对收 获的标准脂肪进行离心,经机械乳化和二次离心后,得到的 脂肪浓缩物其 SVF 细胞浓度比传统纳米脂肪高出约 60%。 Gu 等[30]同样将纳米脂肪以 3000 r/min 离心 3 min,用于 25 例 面部萎缩性瘢痕患者发现,所有患者的面部瘢痕都得到了不 同程度的改善,随访 6 个月临床效果较稳定。 离心可以分离机械过程中产生的大部分油脂,但部分油 脂仍以微小脂滴的形式存在于稳定状态下的乳糜液中,通过 简单的离心并不能破坏这一稳态,甚至增加离心速度仍很难 分离出其中的油脂。鲁峰团队利用絮凝沉淀原理打破纳米脂 肪的内在平衡去除剩余油脂[31-32]。过程是将 0.5 ml 的油脂加 入制备好的纳米脂肪中,并缓慢推注 3~5 次将其混合,待乳 糜液中有絮状物出现后转移到离心机中以 2000 r/min 离心 3 min,弃去下层少量的肿胀液以及上层大量的黄色透明油 脂, 油层下的黏性凝胶样物质即脂肪来源干细胞基质胶(adiposeextracellularMatrix/Stromal vascular fraction gel, SVF- gel)。 SVF- gel 中成熟脂肪细胞几乎完全被破坏,油脂被进一步去 除,富含血管基质片段的细胞外基质结构相对完整并高度浓 缩,SVF 细胞群平均浓度可达正常脂肪组织的 4.5 倍,其中所 含的 ADSCs 更是达到原来的 6.3 倍,且其多向分化能力未受 损害[33]。ECM作为天然细胞载体,为 SVF/ADSCs 提供龛室[34], 确保 ADSCs 和其他附着细胞保持最佳状态,从而进行自我 扩增和参与组织再生,同时 ECM还能够保护 ADSCs 在体内 不被巨噬细胞吞噬,提供更好的细胞成活率[35]。在 SVF- gel 制 作过程中,脂肪细胞虽被破坏,但细胞间连接和 ECM保持完 整。在 SVF 悬液的传统制备过程中,因酶对脂肪组织的破坏 而导致单细胞悬浮,使细胞间的通讯完全中断,在脂肪细胞 被破坏的同时,细胞外基质被消化。当 ADSCs 失去细胞外基 质的庇护被注入机体内时,微环境中缺血缺氧和炎症反应、 注射过程中的机械性损伤以及经过组织间隙的大量流失,均 可导致其在受区的成活率下降,使其发挥的作用受到限制[36]。 因此,在治疗裸鼠糖尿病创面过程中,SVF- gel 促进创面愈合 的能力更强[36]。同样,SVF- gel 具有填充功能,将等量 SVF- gel 以及“标准 Coleman”脂肪注入裸鼠背部,前者具有更好的长 期体积成活率,并逐渐表现为正常脂肪组织[33]。由于成熟脂肪 细胞约占脂肪组织体积的 90%,而数量却不到 7%,因此,传 统脂肪移植后,脆弱的成熟脂肪细胞会因缺氧而发生坏死, 导致脂滴占据移植物中的大部分体积,阻碍脂肪再生。而 SVF- gel 已经清除了大部分“无效组织” —油脂,可完成稳定 的组织再生[33]。然而,在 SVF- gel 的制作过程中,由于最终的 脂肪体积小于原始体积的 15%,不可能大量制备,因此,目前 只适用于小面积的注射,例如面部的精准填充。陈信恺等[37]将 SVF- gel 注入 86 例患者的面部,所有患者面部的饱满度和轮 廓均得以改善,且 1 年内效果良好,仅少数患者需要 2 次手 术。SVF- gel 还可以辅助脂肪移植来提高移植成活率[38],其机 制与细胞辅助脂肪移植(cell- assisted lipotransfer,CAL)技术 相似。SVF- gel 也可通过抑制瘢痕组织的增殖,促进瘢痕下 脂肪组织再生来治疗增生性瘢痕[39]。与普通脂肪移植相比,SVF-gel 注入体内后,其吸收率较低,无需超量注射;与纳米 脂肪相比,它可去除大部分无效油脂以及细胞碎片,清空脂 肪再生的障碍,因此既可以发挥再生作用,又可以进行组织 填充作用。SVF-gel 是超浓缩的纳米脂肪,制备方法简单,且 兼具良好的干细胞疗法和填充功能,在整形外科领域具有广 阔的应用前景。

  4、纳米脂肪 2.0

  纳米脂肪的制作分为乳化和过滤过程。Lo Furno 等[40]认 为,在过滤过程中造成了许多 ADSCs 的丢失,因此,他提出 了 “纳米脂肪 2.0”的概念。相比于经典纳米脂肪的制备, 纳米 脂肪 2.0 省略了尼龙纱布过滤这一步。试验结果表明,纳米脂 肪 2.0 确实含有更丰富的干细胞, 不仅具有明显的增殖能力, 而且也减少了制作过程中脂肪被污染的可能性,提高了脂肪 移植的安全性[41]。由于干细胞密度和增殖率较高, 故推测在移 植后前几天,纳米脂肪 2.0 可能会产生更快、 更有效的再生效 果。Jan 等[42]将未过滤的纳米脂肪注入 49 例患者的面部瘢痕 处, 6 个月后,瘢痕质量显著改善。Goisis 等[43]还曾使用未经过 滤的乳化纳米脂肪治疗泪槽畸形。其存在的不足是,纳米脂 肪 2.0 与纳米脂肪一样,含有过多的油脂以及细胞碎片。因 此,在将来的临床应用中,可以将纳米脂肪 2.0 与离心等纯化 技术联合, 进一步浓缩 ADSCs,以更好地服务于临床。

  5、总结与展望

  纳米脂肪衍生物是保证脂肪组织顺利通过 27 G 针头的 同时, 在纳米脂肪的基础上制备新的脂肪组织。它们打破了纳 米脂肪的局限性, 赋予纳米脂肪新的活力。随着 “微创“”无创” 观念的逐渐深入[44],纳米脂肪及其衍生物必将以其独特的魅 力, 越来越多地应用于整形外科手术, 如瘢痕修复、创面愈合、 精准填充、面部年轻化等,其应用前景十分广阔。然而, 其衍生 物还可应用于哪些疾病模型,远期临床效果如何以及具体作 用的机制, 仍无确切的研究结果, 尚有待今后深入地研究。

  参考文献略。

  来源::郑洋洋, 刘毅. 纳米脂肪衍生物的研究进展[ J ]. 中国美容整形外科杂志, 2019,30(10):631- 633。

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